人SP-A1在pichiapastoris中的表達的制作方法

文檔序號:571107
專利名稱:人SP-A1在pichia pastoris中的表達的制作方法
技術領域
本發明涉及一種DNA的重組技術,特別是涉及人肺表面活性物質相關蛋白人SP-A1在Pichia pastoris中的表達。
肺表面活性物質(pulmonary surfactant,PS)是肺II型細胞合成、分泌的一種脂蛋白復合物,其主要功能是降低肺泡表面張力,保持肺泡擴張,防止肺萎陷,維持正常呼吸生理活動,該復合物由磷脂和蛋白質組成,其中90%為磷脂,以二棕櫚酰卵磷脂(DPPC)和磷脂酰甘油(PG)為主,8~10%為肺表面活性物質相關蛋白(surfactant-associated protein,SP),分為SP-A、SP-B、SP-C和SP-D等,以SP-A含量最為豐富,約占總蛋白量的50%。SP-A是一種多功能糖蛋白,在調節肺表面活性物質的代謝、SP基因表達、肺內免疫及炎癥反應方面具有十分重要的作用。
SP-A是一種親水糖蛋白,單體分子量大約為32Ku,可因其糖基化數目不同,波動在28~36Ku之間,等電點pH4~5。單體SP-A分為4個不連續的區域短的氨基端球狀結構區、富含羥基脯氨酸的膠原樣區(CLR)、與磷脂結合的疏水區和羧基凝集素糖識別區(CRD)。人類SP-A基因位于第10號染色體長臂中部,SP-A基因全長約5kb,含有7個外顯子,其中4個外顯子的部分或全部為編碼序列。SP-A基因包含著一個基因家族—SP-AI、II和偽基因,與兩個功能基因相對應的cDNA為6A和1A,兩者在核酸水平有94%的同源性,在氨基酸水平有96%的同源性,非常相似。每一個功能基因都編碼一種SP-A蛋白前體,分子量約為200~250Ku,需經一系列翻譯后修飾得到唾液酸糖蛋白。成熟的人SP-A肽鏈有2型(SP-AI、SP-AII),兩者同源性達96%,僅有6個氨基酸殘基不同。SP-AI與SP-AII以2∶1的比例纏繞成一個亞基,6個三螺旋結構亞基又通過共價鍵和非共價鍵連接在一起,形成一個分子量約為700Ku的具有生物活性的大分子。在肺泡內表面,SP-A多以18聚體的形式存在,呈一束花狀,主莖由膠原樣區構成,花葉則是植物凝集素樣區。
臨床所使用的SP-A均為動物肺組織或人羊水提取物,由于提取工藝的不完善,水溶性SP-A大量丟失,制約了PS的功能及SP-A的應用。另一方面,由于蛋白質的免疫原性,SP-A藥品不能象PS磷脂組分一樣由動物肺組織提取,由人肺組織和羊水提取也在數量和倫理上明顯受限。
迄今為止,所有在原核細胞表達系統表達活性SP-A的努力均告失敗,在哺乳動物細胞表達系統表達非人SP-A的研究雖有成功的報導,但尚無人SP-A的基因工程產品報道。
本發明的目的是利用真核表達系統Pichia pastoris生產大量、高活性的人SP-A1。
本發明中的人SP-A1基因是根據論文“肺表面活性物質結合蛋白AcDNA克隆及序列分析”中所記載的內容克隆得到的,該文獻源自《中華兒科》雜志2000,38(3),P153。
本發明中的表達載體為pPIC9K,也可以是相應酵母胞內及分泌表達載體。
本發明中的宿主細胞為Pichia pastoris。
本發明首先將人SP-A1基因克隆至表達載體中,通過電擊轉化技術轉入P.pastoris,并從轉化菌株中篩選出多拷貝轉化子,用高表達的甲醇氧化酶1基因(AOX1)啟動子、可利用甲醇作為唯一碳源誘導對重組P.pastoris進行表達。其具體步驟為1.人SP-A1基因克隆。
2.通過轉化、質粒抽提、酶切等方法篩選重組的陽性克隆,并進行序列分析。
3.表達載體的構建及序列測定,以保證翻譯讀框的正確。
4.基因整合的鑒定。
5.表達產物的鑒定。
6.表達產物的活性測定。
由于本發明采用甲醇營養型酵母表達系統,因此,具有如下優點(1)應用AOX啟動子,轉錄效率高,易于誘發調控;(2)表達質粒易于整合到基因組,不易丟失,適于高密度發酵,產量高;(3)表達產物分揀進入過氧化物酶體等有利于純化;(4)能進行翻譯時/后的修飾。
通過對表達產物的鑒定可知,人SP-A1在P.Pastoris中成功地獲得表達,而且表達的目的蛋白質能對巨噬細胞殺傷病原體發揮調理作用。
下面將結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。


圖1是pPIC9K/SP-A1和pPIC9K的限制性酶切圖。
圖2是pPIC9K/SP-A1和pPIC9K的PCR。
圖3是克隆至T載體用T7和SP6引物測序圖。
圖4是SP-A1在Saccharomyces cerevisiae S-78及Pichia pastoris GS115中的表達12%SDS-PAGE。
圖5是SP-A1經HPLC純化的目的峰。
圖6是SP-A1的Western雜交檢測。
圖7是SP-A調理肺巨噬細胞對大腸桿菌J5的殺傷率。
實施例本實施例中所涉及的質粒pPIC9K、酵母菌株Pichia postoris GS115、KM71、SMD1168、GS115 Albumin、GS115 β-Gal均購自Invitrogen公司。
本實施例中所涉及的用于擴增目的基因SP-A和鑒定轉化子的PCR引物由上海生工生物有限公司合成。
本實施例中所涉及的主要酶類及試劑包括DNA限制內切酶、T4DNA連接酶、Taq酶購自大連寶生物工程有限公司和華美生物有限公司,酵母裂解酶、G418、玻璃珠購自Sigma公司。
本實施例的操作步驟如下1.培養基YPD、MGY、MGYH、RD、RDH、RDB、RDHB、MD、MDH、MM、MMH、BMG、BMM、BMGY、BMMY所需試劑均為市售,其濃度按說明配制。
2.SP-A1基因表達載體的構建 設計擴增引物(+)5’-GATACGTAATGTGGCTGTGCCCTCTG-3’(-)5’-GCGGAATTCGAACTCACAGATGGTCAG-3’用重組質粒pUC19/SP-A1作為模板擴增人SP-A1基因,PCR產物用SnaB I和EcoR I酶切后純化目的片段與相同酶切的pPIC9K連接,構建pPIC9K/SP-A1。
3.E.coli JM109感受態的制作及轉化在平板挑取E.coli JM109或TOP10F’單菌落于2ml的LB中,37℃,250rpm振蕩培養10~12小時,取0.5ml種子液接種于50ml的LB中,37℃,250rpm培養至A600為0.6,約需1.5~2.0h;置培養物于冰上10min,移入50ml離心管中,4℃,4000rpm離心5min;棄上清,加入15ml濃度為0.1mol/L的預冷(4℃)CaCl2懸浮細胞,冰浴30min;4000rpm,4℃離心10min回收細胞,棄上清,加入2ml預冷CaCl2懸浮細胞,冰浴備用;取100μl感受態細胞,加入10μl連接液,混勻,冰浴30min;42℃熱休克90秒,迅速放回冰中2min,加入500μl LB培養液37℃培養1h;取150μl培養液涂布于含氨芐青霉素50~100μg/ml的LB平板,37℃倒置培養12小時。篩選目的重組子,其中含重組質粒pPIC9K/SP-A1。
4.重組質粒的鑒定在含氨芐青霉素100μg/ml的LB平板挑取單菌落置于含氨芐青霉素50-100μg/ml的LB中,振蕩培養10~12小時;按常規堿裂解方法或純化試劑盒提取質粒;用限制性內切酶SnaB I和EcoR I進行酶切鑒定;酶切正確的質粒用α因子引物(+)5’TACTATTGCCAGCATTGCTGC3’(-)5’CAAATGGCATTCTGACATCC3’擴增,進行序列分析,確保讀框及序列正確。
5.質粒的準備將正確構建的重組質粒pPIC9K/SP-A1及親本質粒pPIC9K在大腸桿菌JM109或TOP10F’中擴增,用質粒抽提試劑盒提取所需的質粒,然后用Sal I進行限制性酶切,使之完全線性化,0.8%瓊脂糖電泳后用膠回收試劑盒回收線性化質粒溶于1×TE中。
6.酵母菌株的轉化分別挑取P.pastoris GS115、SMD1168和KM71單菌落,接種于5ml的YPD置于50ml三角瓶中,30℃培養10小時,取50~100μl接種于50mlYPD中,振蕩培養16小時至A600=1.3~1.5;4℃離心1500g×5min,沉淀用50ml預冷的滅菌ddH2O重懸;同前離心,沉淀用25ml預冷的滅菌ddH2O重懸;同前離心,沉淀用5ml預冷的1M山梨醇重懸;同前離心,沉淀用1.5ml預冷的1M山梨醇重懸備用;將酵母感受態細胞分裝為80μl/份;5~20μg的線性化DNA加入感受態酵母菌株中,轉移至0.2cm的電極杯,置冰上5分鐘;用Bio-Rad GenePulser進行電擊轉化,其參數為1500V、25μF、400Ω,立即加入預冷的1M山梨醇1ml,200~600μl/份涂MD和RDB選擇平板,置28℃培養48h至轉化子出現。
7.多拷貝整合事件的篩選(1)采用無菌操作技術在96孔培養板的每孔加入200μl YPD,每孔接種一個轉化子,并使菌體懸浮于YPD培養基中,置于30℃培養2天;(2)分別取種子液10μl接種于另一96孔培養板各含有200μl YPD相應的培養孔,30℃培養1天;(3)重復步驟(2)一次;(4)取10μl接種于含G418終濃度分別為0.5,0.75,1.0,1.5,2.0,3.0mg/ml的YPD或MD固體培養板,待液體完全吸附后,置30℃培養,于接種后2,3,4,5天觀察生長菌落,抗性越高,整合的拷貝數越多。
8.篩選GS115His+Mut+/His+Muts表型用Sal I線性化質粒轉化GS115或SMD1168菌株,產生的重組菌株可以存在兩種表型His+Mut+/His+Muts表型,用GS115 Albumin和GS115β-Gal分別作為His+Muts、His+Mut+的對照,而KM71僅有His+Muts表型。
(1)挑取在MD或RDB平板上的單菌落分別依次接種在MM和MD平板上,以GS115/β-Gal和GS115/Albumin作為對照。30℃培養36~48小時。
(2)根據菌落在MM和MD生長的速度不同判斷其表型,MM和MD平板生長良好為His+Mut+表型,MD平板生長良好而MM平板生長緩慢或不生長為His+Muts表型。
9.酵母總DNA的提取將培養16小時的培養液(重組菌和親本GS115、KM71、SMD1168)1.5ml移至Eppendorf管,離心30秒,棄上清;沉淀中加入45μl裂解酶緩沖液重懸,加入5μl酵母裂解酶,振蕩后于37℃孵化1h,不時進行振蕩;加入10μl蛋白酶K,振蕩數秒,55℃孵化15min,不時振蕩;加入5μl RNase A,常溫下放置15min;加入500μl抽提液,振蕩,常溫下放置10min,不時振蕩;離心,12000~16000r/min×2min,沉淀細胞脆片,將上清移入GFX柱中,5000g×1min倒掉收集管中液體,重新將吸附柱放至收集管中,加入500μl抽提液,8000r/min×1min倒掉收集管中液體,加入500μl洗滌溶液,12000~16000r/min×3min;移去收集管,將吸附柱放至無菌Eppendorf管中,加入200μl的洗脫緩沖液或滅菌ddH2O,室溫放置1min;8000r/min×1min,收集純化的DNA,0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
10.酵母整合的PCR分析設計如下反應體系10×PCR buffer 5μlGenomic DNA(~1μg)5μl100mM dNTP(25mM each) 1μl5’AOX1 Primer(0.1μg/μl) μl3’AOX1 Primer(0.1μg/μl) μlTaq Polymerase(5U/μl) 0.25μlddH2O加至總體積為50μl重組質粒作為陽性對照,相應的空質粒作為另一個對照,其熱循環參數如表1所示。
表1 熱循環參數步驟溫度時間循環數Hot Start 94℃2min 1Denaturation 94℃1minAnnealing 55℃1min25Extension 72℃1minFinal Extension72℃7min 1取10μl樣品進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。
11.重組P.pastoris的表達挑取His+Mut+單菌落,置于盛有25ml的BMG的250ml搖瓶中,28℃、250r/min培養至A600=2~6(約16~18h),常溫下1500~3000g×5min離心沉淀菌體,去上清,用BMMY重懸菌體至A600=1.0(約200ml),置于1000ml的搖瓶中96h,分別于0h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h取樣1ml,離心取上清儲存-80℃待進一步電泳分析。每24h加100%甲醇至培養基中使終濃度為0.5%,維持誘導表達。
12.SDS-PAGE分析取各個時間點的樣品融化并置于冰上,旋轉蒸發或超濾濃縮樣品至原體積的1/5~1/10,等體積加入電泳上樣緩沖液,煮沸10min,上樣進行12%SDS-PAGE電泳。余樣品置于-20℃備用,上清置于-80℃留待進一步分析。
13.SP-A1在P.pastoris中的表達及產物純化上述表達獲得的上清經旋轉蒸發(冷凍干燥SentryTMVirTis公司)濃縮至1/5~1/10,以固體Tris調pH至6.5離心除去沉淀的雜蛋白后,經Sephadex G-25層析柱分批脫鹽,收集蛋白洗脫液(約25ml),經Sepharose 4B和Sephadex G-75層析。
14.高效液相色譜(HPLC)純化產物經C-8柱純化,用乙晴和水洗脫,于20min處得到蛋白峰。
15.Western雜交接常規方法處理蛋白質樣品并進行SDS-PAGE;電泳完成后,拆卸凝膠夾層,去除積層膠。以適量的轉移緩沖液室溫平衡凝膠30min.;準備硝酸纖維素膜(NC膜),按凝膠大小但比凝膠大約1mm,成45°角慢慢將凝膠放入蒸餾水中,水將會滲入膜中并濕潤整個表面。然后在轉移緩沖液中平衡10~15min;在塑料轉移盒的底邊,依次將下面物品組裝轉印夾層海綿、數張剪切得如凝膠大小的濾紙,并預先以轉移緩沖液濕潤凝膠、NC膜、數張已濕潤的濾紙、海綿,組裝過程注意排除所有氣泡;往轉移槽中加入轉移緩沖液,按正確的極性方向將轉移盒放進電轉儀中,連接電源;在冷卻條件下100V電轉移30~60min,拆卸轉印裝置,取出NC膜,并在膜上剪一小角作為標記;凝膠用考馬斯亮藍染色以確定轉移效率;將膜放入可熱密封的塑料袋,加5ml封閉液,密封塑料袋,在旋轉搖床或擺動平臺中搖動30~60min;用封閉液稀釋鼠抗人SP-A(1∶3000);傾去封阻液,加入稀釋的第一抗體,4℃過夜;帶著手套從塑料袋中取出NC膜,放在塑料盒中搖動,用20ml PBST洗滌4次,每次10~15min;用PBS稀釋HRP標記羊抗鼠IgG(1∶5000);將NC膜放進新的塑料袋子,37℃ 1h,取出NC膜,室溫下以PBS洗膜15min去除過量的磷酸鹽和Tween20;將膜放入發色底物顯色液,條帶在10~30min內出現;用蒸餾水洗膜,終止反應,晾干后拍照或直接拍照。
16.SP-A1的調理作用(1)鼠巨噬細胞的分離肺巨噬細胞按文獻Journal of Infectiousdiseases 1995;172(2)P481中報道的方法由無特殊病原體的雄性大鼠中分離,重懸在A緩沖液,該緩沖液的組成為140mM NaCl、5mM KCl、2.5mMNa2PO4、10mM HEPES、2mM MgSO4、6mM葡萄糖、2mM CaCl2、0.1%明膠(wt/vol),pH為7.4。懸液中肺巨噬細胞終濃度為107細胞/ml。
(2)SP-A的準備天然豬SP-A和重組的SP-A1(釀酒酵母P1和P.pastoris P2)溶解于5mM HEPES,pH為7.4,分成若干份保存于-70℃備用。
(3)細菌培養E.coli J5分別培養于LB培養基中,37℃振蕩培養過夜,常溫下離心,3000g×2min收集細菌,用A緩沖液洗滌3次,離心,2500g×10min,A緩沖液重懸,熒光分光光度計測定使其終濃度為5×108cfu/ml。
(4)細菌殺傷實驗在有或無SP-A和/或肺巨噬細胞存在時,實驗其吞噬殺傷活性。采用細菌/巨噬細胞比為1∶1,保證細菌被有效地攝取,不同劑量SP-A加入至混合液中,終體積為200μl,輕度晃動,37℃孵化30min,加入預冷的ddH2O中止吞噬和殺傷作用,用等體積的LB稀釋后涂瓊脂平板,37℃培養過夜,計數克隆。三、結果1.pPIC9K/SP-A1重組表達載體的鑒定用SnaB I和EcoR I限制性酶切分析發現可切出目的片段,如
圖1所示,
圖1中的1為DNAMarkers,2、3為pPIC9K,4、5為pPIC9K/SP-A1。重組質粒及親本質粒經α因子引物擴增分別得到936bp和188bp的片段,如圖2所示,圖2中的1~3為pPIC9K/SP-A1,4為Markers,5~6為pPIC9K??寺≈罷載體用T7和SP6引物測序結果,序列及讀框完全正確,如圖3所示,由此說明已成功構建pPIC9K/SP-A1表達載體。
2.酵母轉化結果用Sal I線性化質粒轉化的GS115,其表型為HIS4Mut+有167個菌落,表型為HIS4+Muts有28個菌落,二者之比約6∶1,可見所獲得的轉化子絕大部分是利用AOX1啟動子的快速生長型。轉化SMD1168獲得類似的結果。G418濃度為3.0mg/ml時宿主為GS115、SMD1168和KM71的轉化子分別有23、18、21個。
3.SP-A1在P.pastoris中的誘導表達重組菌株在甲醇濃度為0.1~1.0%(g/ml)時表達,甲醇濃度0.5%時誘導表達效果最佳,培養72h,蛋白質達到最大表達量,即150mg/L,不同菌株其表達量范圍為0mg/L~150mg/L。SP-A1在Saccharomyces cerevisiaeS-78及Pichia postoris GS115中的表達12%SDS-PAGE如圖4所示,其中,1為Protein Markers,2為SP-A1(S-78),3為SP-A1(GS115)。
4.產物的純化表達產物經Sephadex G-25、Sepharose 4B和SephadexG-75得到大小約為32kD的目的蛋白質。
5.HPLC純化后得到目的峰如圖5所示。
6.用抗SP-A的抗體進行Western雜交檢測利用ELISA方法分別檢測天然SP-A及基因表達產物的免疫原性,可見兩反應曲線的特征相似,都是典型的S型曲線,表明SP-A1的抗原特性與天然SP-A的相同,圖6所示為表達在Pichia pastoris中的SP-A1的Western雜交,其中,1為pPIC9K/GS115,2為pPIC9K-SP-A1/GS115。
7.SP-A的調理作用37℃孵化30min,觀察在有或無肺巨噬細胞和SP-A存在時細菌成活率,肺巨噬細胞單獨殺傷率為5.6%±2%,當加入SP-A時殺傷效率明顯增加,而SP-A本身對細菌無影響,SP-A調理肺巨噬細胞對大腸桿菌J5的殺傷率如圖7所示。
權利要求
1.人SP-A1在Pichia pastoris中的表達,其特征是將人SP-A1基因克隆至表達載體中,通過電擊轉化技術轉入P.pastoris,并從轉化菌株中篩選出多拷貝轉化子,用高表達的甲醇氧化酶1基因(AOX1)啟動子、利用甲醇作為唯一碳源誘導對重組P.pastoris進行表達。
2.根據權利要求1所述的人SP-A1在Pichia pastoris中的表達,其特征是在所述的人SP-A1基因表達載體的構建中,所設計的擴增引物為(+)5’-GATACGTAATGTGGCTGTGCCCTCTG-3’(-)5’-GCGGAATTCGAACTCACAGATGGTCAG-3’。
3.根據權利要求1或2所述的人SP-A1在Pichia pastoris中的表達,其特征是所述的電擊轉化參數為1500V、25μF、400Ω。
4.根據權利要求1所述的人SP-A1在Pichia pastoris中的表達,其特征是所述的甲醇濃度為0.1~1.0%(g/ml)。
5.根據權利要求4所述的人SP-A1在Pichia pastoris中的表達,其特征是所述的甲醇濃度最佳值為0.5%(g/ml),培養時間為72h。
全文摘要
本發明公開了人SP-Al在Pichia.pastoris中的表達,該方法將人SP-Al基因克隆至表達載體中,通過電擊轉化技術轉入Pichia.pastoris,并從轉化菌株中篩選出多拷貝轉化子,用高表達的甲醇氧化酶1基因(AOXl)啟動子、利用甲醇作為唯一碳源誘導對重組P.pastoris進行表達;在所述的誘導表達中,甲醇濃度為0.1~1.0%(g/ml)。本發明能生產大量、高活性的人SP-Al,其最大表達量可達150mg/L,而且所表達的目的蛋白質能對巨噬細胞殺傷病原體發揮調理作用。
文檔編號C12N15/12GK1372001SQ01107600
公開日2002年10月2日 申請日期2001年2月28日 優先權日2001年2月28日
發明者封志純, 蘭和魁 申請人:珠江醫院
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